基本信息
题目：Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression
期刊：Cell
作者及单位： 杜鹏为该论文的通讯作者。北京大学前沿交叉学科研究院博士生申辉、生命科学学院博士生杨敏和前沿交叉学科研究院博士生李诗雨为本文的并列第一作者。
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研究背景
胚胎干细胞（ESCs）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，通常指哺乳动物体内的合子、2-细胞卵裂球和4-细胞卵裂球。它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
干细胞研究广泛涉及再生医学、辅助生殖、癌症、代谢紊乱和衰老等方面，因此在体外捕获并维持有高分化潜能的ESCs是十分重要的。
剪接体是具有五个核心亚单位和几个辅因子的大分子核糖核蛋白(RNP)复合物，并且是mRNA剪接和成熟的动态分子机器。研究表明，剪接体也可以直接控制转录的起始、延伸和终止。但剪接体在干细胞命运转变和早期胚胎发育中可能的生理相关性尚不清楚。
5月14日，北京大学生命科学学院/北大-清华生命科学联合中心杜鹏研究员课题组在Cell杂志在线发表了题为“Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression”的研究论文。该研究中，作者通过抑制剪接体，实现了小鼠全能性干细胞的体外建立和培养，并将该类在分子和功能上都接近于体内2细胞和4细胞时期胚胎的细胞命名为全能卵裂球样细胞（totipotent blastomere-like cells，TBLCs）。本研究首次建立了体外捕获和培养全能性干细胞的方法，对于早期胚胎发育相关的基础研究提供了新的研究体系，同时也为干细胞相关的临床医学研究提供了全新的发育潜能极高的“种子细胞来源”。
研究思路及结果展示
图1.小鼠全能性干细胞形成过程（来自文章）
作者分析了之前研究发现的某一类剪接因子具有在早期胚胎中表达量低，但在后期表达量逐渐升高的现象。在本研究中，作者通过敲低这一类剪接因子，可以激活全能性基因，沉默多能性基因，从而将多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）重新编程为全能状态。
将剪接体抑制剂（Pladienolide B，PlaB）添加到Serum/ LIF培养基中（SLP培养基），能够在体外培养和维持TBLCs。与多能干细胞PSCs相比，TBLCs在SLP培养基中培养5代之后，整体转录组趋于稳定(图2A)，特异性表达胚胎时期的全能性基因、沉默囊胚时期特异性表达的多能性标记基因，该状态下的TBLCs接近体内胚胎的2细胞和4细胞时期。
撤去PlaB后，TBLCs细胞能够转换到多能性状态，说明单个剪接抑制剂PlaB可以操纵多能干细胞和全能干细胞之间的转换。
图2.TBLC转录组稳定（来自文章）
A. 热图和气泡图显示了在SLP培养基中不同传代培养的小鼠ESCs和小鼠植入前胚胎中具有代表性的多能和全能基因的相对表达。
本研究中利用剪接体抑制剂体外获得并培养了TBLCs，且在单细胞转录组、翻译组、DNA甲基化组和染色质可及性上具有与2细胞、4细胞时期相似的分子特征。
单细胞转录组测序结果分析
本研究对PSCs和TBLCs进行了单细胞转录组测序（scRNA-seq）。使用23个多能性标记基因和30个全能性基因以及转座子Mervl和Mt2，区分了PSCs和TBLCs，发现99.75%的TBLCs来自SLP培养基，说明SLP培养基能培养和维持TBLCs细胞的同质性（图3A）。与对照PSCs相比，作者在转染了针对SNRPD2、SNRPB、ISY1、EFTUD2和LSM4的单个siRNA的细胞中以及在SLP培养基中培养的TBLCs中检测到1200上调的基因和1174个下调的基因（图3B）。
图3.单细胞测序结果分析（来自文章）
A. SLP培养基中TBLCs和血清/LIF培养基中的PSCs的scRNA序列分析。
B. 与PSCs相比，TBLCs（转染siRNA的细胞和在SLP培养基中培养细胞）以及小鼠植入前胚胎中常见上调和下调基因的相对表达热图
翻译组测序结果分析
本研究通过翻译组测序（Ribo-seq），发现了与PSCs相比，TBLCs中有2581个基因翻译上调、837个基因翻译下调，分别包含全能基因（包括ZSCAN4s、DDIT4L、SP110、GM8300和SNAI1）和多能基因（包括POU5F1、ZFP42、SOX2和NR0B1）。TBLCs在翻译水平上具有明显的特征，全能基因翻译上调，多能基因翻译下调。
图4.翻译组测序结果分析（来自文章）
A. 在SLP培养基中培养的TBLCs和在血清/LIF培养基中培养的PSCs的翻译组分析，以及显示整体翻译变化的火山图。
B. 基于Ribo-seq数据显示TBLCs与PSCs中P和T基因相对翻译变化的直方图。
全基因组亚硫酸氢盐测序分析结果
本研究通过全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），研究了PSCs和TBLCs的DNA甲基化组。研究结果发现PSCs中的整体甲基化水平为71%，接近E6.5-E7.5时期胚胎；而TBLCs与之相比甲基化水平大幅降低至35%，类似于体内2细胞和4细胞胚胎（整体甲基化程度分别为47%和41%）。通过进一步分析发现，与PSCs相比，TBLCs中基因和启动子区域的DNA甲基化水平降低。
图5.全基因组亚硫酸氢盐测序结果分析（来自文章）
A. 基于WGBS的TBLCs、PSCs和小鼠胚胎的全局CpG甲基化水平的直方图
B. PSCs和TBLCs中对应于不同基因组区域的相对CpG甲基化水平的热图
染色质可及性测序分析结果
由于染色质可及性与早期胚胎发育期间的基因表达具有密切相关性，本研究使用诺唯赞建库产品Vazyme #TD501进行染色质可及性测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing，ATAC-seq）。ATAC-seq结果显示，与PSCs相比，TBLCs在转录起始位点（TSS）附近的开放峰和封闭峰均与小鼠2细胞、4细胞胚胎时期显示出相似的开放或封闭状态，这意味着TBLCs具有与早期胚胎相似的染色质可及性（图6A、B）。在不同基因组位点的转座子MERVL和MT2周围出现开放峰，与PSCs相比，MERVL和MT2这两个转座子在TBLsC中的表达诱导非常吻合（图6C）。
图6.染色质可及性测序结果分析（来自文章）
A. PSCs、TBLCs、2细胞卵裂球和4细胞卵裂球的ATAC-seq结果。(热图显示，与PSCs以及2细胞和4细胞卵裂球相比，TBLCs中转录起始位点（TSS）周围出现开放或闭合的峰值，并根据在SLP培养基中培养的ESCs的RNA-seq显示相关基因的相对表达。折线图显示了相关基因的相对峰值富集和动态表达。)
B. 整合基因组学查看器（IGV）显示代表性全能性标记基因和多能性标记基因周围的ATAC-seq峰。
C. IGV显示转座子MERVL（红色）和MT2（绿色）附近的ATAC-seq峰。