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辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书
酶标法 100管/48样
测定意义
辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。
需自备的仪器和用品
酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
酸性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
碱性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体10 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体3 mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1瓶，-20 ℃保存，用时加入3mL双蒸水，混匀，用不完的试剂4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4 ℃保存，用时加入3mL双蒸水，混匀，用不完的试剂仍4℃保存；
试剂五：液体3.6mL×1瓶，4 ℃保存；
试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。
NAD+和NADH的提取
1 血清（浆）中NAD+和NADH的提取
NAD+的提取：取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADH的提取：取约0.1mL血清（浆），加入1mL碱性提取液，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2组织中NAD+和NADH的提取：
NAD+的提取：称取约0.1g组织，加入1mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADH的提取：称取约0.1g组织，加入1mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3 细胞或细菌中NAD+和NADH的提取：
NAD+的提取：先收集500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加入1mL酸性提取液，超声波破碎1min（强度20％，超声2s，停1s），煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADH的提取：先收集500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加入1mL碱性提取液，超声波破碎1min（强度20％，超声2s，停1s），煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）
试剂名称(μL) 对照管 测定管
样本 20 20
试剂一 80 80
试剂二 30 30
试剂三 30 30
试剂四 30 30
试剂五 30 30
试剂六 200 混匀，室温避光静置20min
试剂六 200
充分混匀，静置5min后，20000g，常温离心5min，弃上清，沉淀中加入：
试剂七 400 400
混匀，取200μL转移至96孔板中，570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。
注意事项
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NAD+或NADH.
NAD+和NADH含量的计算
（一）NAD+含量的计算
1、血清（浆）中NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL）= (△A -0.099）×722
2、组织中NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot）= (△A -0.099）×36.1÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD+(nmol/g 鲜重）= (△A -0.099）×36.1÷(W÷V样总)
3、细胞或细菌中NAD+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot）= (△A -0.099）×36.1÷Cpr
(2)按细菌或细胞密度计算
NAD+(nmol/104 cell）= (△A -0.099）×36.1÷(500÷V样总)
（二）NADH含量的计算
1、血清（浆）中NADH含量计算
NADH含量(nmol/mL）= (△A -0.065）×494
2、组织中NADH含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）= (△A -0.065）×24.7÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重）= (△A -0.065）×24.7÷(W÷V样总)
3、细胞或细菌中NADH含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）= (△A -0.065）×24.7÷Cpr
(2)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/104cell）= (△A -0.065）×24.7÷(500÷V样总)
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g; V样总：加入提取液体积，1mL；500：细胞或细菌总数，500万。
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