实验步骤：
一、细胞复苏
1.从液氮中取出保存的细胞，放入一次性手套于37℃水浴锅中摇晃快速溶解，大约1 min；
2.1000 rpm离心5 min；
3.吸出冻存液，加入相应的细胞培养液重悬细胞；
4.然后转移到培养瓶中，添加足量的培养液；
5.放入5%CO2、37℃培养箱中培养，隔天更换新的培养液。
注意事项：1.从液氮罐中取出细胞时，应做好个人防护以免冻伤；2.冻存细胞取出后，如不能立即放入水浴锅中融化，需将其放在干冰上保存转移；3.细胞水浴解冻时间以1min内为宜，做到慢冻速融；4.已解冻的细胞避免长时间常温存放，需尽快离心去除DMSO；5.刚复苏的细胞贴壁尚不牢固，24h内不要频繁观察和换液；6.将培养瓶放入培养箱，并将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换（如使用透气性瓶盖，则无需旋松瓶盖）。
二、细胞传代
贴壁细胞传代（以T25瓶为例）
当细胞密度达到80-90%就可传代。
1.首先将旧的培养基吸出弃掉，加入2 mL PBS缓冲液清洗，轻轻摇晃培养瓶使死细胞脱落，吸出PBS，再加PBS重复清洗一次；
2.加入1 mL 0.25%胰蛋白酶以消化细胞，静置1 min，观察到培养瓶内边缘脱落，吸走胰酶；
3.加入2 mL培养液，终止消化；
4.轻轻吹打细胞至成单细胞悬液。按照1：2-1：4的比例传入新的培养瓶中，加入新的培养基，放入5%CO2、37℃培养箱中培养。
注意事项：1.PBS润洗细胞时，从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入PBS，避免冲刷到细胞层；2.不同细胞的胰酶所需消化时间不一样，消化时间根据细胞贴壁特性而定，可每30s观察一次。
悬浮细胞传代（以T25瓶为例）
在显微镜下观察细胞的状态及密度是否可传代。
方法一：
1.从培养箱中取出培养瓶，轻轻晃动使细胞分布均匀；
2.吸取200ul细胞悬液计数，根据计数结果进行适当比例传代；
3.将细胞分装到培养瓶中，加入适量的新鲜培养基，并做好标记；
4.将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。
方法二:
1.将细胞悬液转移至离心管中，以800r/min离心3-5min；
2.吸弃上清液；
3.用1ml预热培养基重悬细胞沉淀，根据沉淀量将细胞稀释，然后分装到培养瓶中，将10ml的培养基加入培养瓶中，并做好标记；
4.将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。
注意事项：悬浮细胞需要用未经TC处理的细胞瓶或培养皿培养，如悬浮细胞无碎片，建议按方法一传代。
三、细胞冻存
最佳保种时期是细胞的第3-10代，遵照“慢冻快融”的原则。
1.提前配制好冻存液，备用；
2.吸除旧的培养基，用PBS清洗两次；
3.加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，尽量吸尽胰酶，加入提前配好的冻存液终止消化；
4.对细胞计数，调整浓度到2×106/mL左右；
5.将细胞悬液分装到保种管中，封口，标明名称、日期、代数等；
6.将保种管于4℃放30 min，-20℃放2 h，-80℃放置过夜，之后就可放入液氮中长期保存。
注意事项：1.选取对数生长期的细胞进行冻存，此时细胞状态比较好；2.冻存的细胞不易长期在-80℃环境中存储，应尽快转入液氮罐中；3.细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮中长期保存，为稳妥起见，可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况再继续冻存；4.不同冻存液的冻存方式不一样，详见说明书。
一、细胞复苏
1.从液氮中取出保存的细胞，放入一次性手套于37℃水浴锅中摇晃快速溶解，大约1 min；
2.1000 rpm离心5 min；
3.吸出冻存液，加入相应的细胞培养液重悬细胞；
4.然后转移到培养瓶中，添加足量的培养液；
5.放入5%CO2、37℃培养箱中培养，隔天更换新的培养液。
注意事项：1.从液氮罐中取出细胞时，应做好个人防护以免冻伤；2.冻存细胞取出后，如不能立即放入水浴锅中融化，需将其放在干冰上保存转移；3.细胞水浴解冻时间以1min内为宜，做到慢冻速融；4.已解冻的细胞避免长时间常温存放，需尽快离心去除DMSO；5.刚复苏的细胞贴壁尚不牢固，24h内不要频繁观察和换液；6.将培养瓶放入培养箱，并将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换（如使用透气性瓶盖，则无需旋松瓶盖）。
二、细胞传代
贴壁细胞传代（以T25瓶为例）
当细胞密度达到80-90%就可传代。
1.首先将旧的培养基吸出弃掉，加入2 mL PBS缓冲液清洗，轻轻摇晃培养瓶使死细胞脱落，吸出PBS，再加PBS重复清洗一次；
2.加入1 mL 0.25%胰蛋白酶以消化细胞，静置1 min，观察到培养瓶内边缘脱落，吸走胰酶；
3.加入2 mL培养液，终止消化；
4.轻轻吹打细胞至成单细胞悬液。按照1：2-1：4的比例传入新的培养瓶中，加入新的培养基，放入5%CO2、37℃培养箱中培养。
注意事项：1.PBS润洗细胞时，从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入PBS，避免冲刷到细胞层；2.不同细胞的胰酶所需消化时间不一样，消化时间根据细胞贴壁特性而定，可每30s观察一次。
悬浮细胞传代（以T25瓶为例）
在显微镜下观察细胞的状态及密度是否可传代。
方法一：
1.从培养箱中取出培养瓶，轻轻晃动使细胞分布均匀；
2.吸取200ul细胞悬液计数，根据计数结果进行适当比例传代；
3.将细胞分装到培养瓶中，加入适量的新鲜培养基，并做好标记；
4.将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。
方法二:
1.将细胞悬液转移至离心管中，以800r/min离心3-5min；
2.吸弃上清液；
3.用1ml预热培养基重悬细胞沉淀，根据沉淀量将细胞稀释，然后分装到培养瓶中，将10ml的培养基加入培养瓶中，并做好标记；
4.将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。
注意事项：悬浮细胞需要用未经TC处理的细胞瓶或培养皿培养，如悬浮细胞无碎片，建议按方法一传代。
三、细胞冻存
最佳保种时期是细胞的第3-10代，遵照“慢冻快融”的原则。
1.提前配制好冻存液，备用；
2.吸除旧的培养基，用PBS清洗两次；
3.加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，尽量吸尽胰酶，加入提前配好的冻存液终止消化；
4.对细胞计数，调整浓度到2×106/mL左右；
5.将细胞悬液分装到保种管中，封口，标明名称、日期、代数等；
6.将保种管于4℃放30 min，-20℃放2 h，-80℃放置过夜，之后就可放入液氮中长期保存。
注意事项：1.选取对数生长期的细胞进行冻存，此时细胞状态比较好；2.冻存的细胞不易长期在-80℃环境中存储，应尽快转入液氮罐中；3.细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮中长期保存，为稳妥起见，可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况再继续冻存；4.不同冻存液的冻存方式不一样，详见说明书。
