在Western Blot (WB) 技术中，上样前的样品蛋白煮沸是一个重要的步骤，其目的是使蛋白质变性，从而消除其空间结构，只保留一级结构。这样，在电泳过程中，蛋白质的迁移率只受其分子量的影响，而不是其三维结构，从而确保电泳结果的准确性。蛋白煮沸和不煮对WB实验都有哪些影响呢？1 蛋白煮沸对结构影响：煮沸可以打开蛋白质的二级结构，使其伸展为一维线性结构，这有助于蛋白质按照分子量进行电泳分离。煮沸过程中加入的SDS（十二烷基硫酸钠）可以破坏蛋白质的氢键，使蛋白质去折叠，并带上均匀的负电荷。不煮的蛋白结构和生物活性保持相对完整。2 煮沸对蛋白抗原性的影响：煮沸可能会破坏蛋白质的抗原性，影响抗体与其结合的能力。但是，煮沸也是必要的，因为它可以暴露蛋白质内在的抗原，使抗体能够充分与抗原结合。3 煮沸时间和温度：煮沸的时间和温度对实验结果有影响。通常，蛋白样品会在100°C下煮沸5到10分钟。有研究者建议70°C煮沸4分钟以减少蒸发。4 煮沸后的样品处理：煮沸后的样品应进行离心，以去除可能形成的沉淀，避免在电泳过程中造成拖尾现象。5煮沸与否的实验对比：有研究者进行了煮沸与否的对比实验，发现未煮沸的样品在WB中的条带灰度值明显比其他的大，这可能与煮沸过程中的蒸发或蛋白抗原性的破坏有关。6 膜蛋白的特殊情况：对于膜蛋白，有研究表明煮沸样本可能会对WB结果产生影响，但具体情况可能因蛋白而异。7 蛋白样品制备：在蛋白浓度测定后，建议将样品稀释到固定浓度，并加入loading buffer后煮沸3-5分钟，以确保蛋白充分变性。