细胞内蛋白互作可视化验证:研究两个蛋白间的相互作用,可以通过BiFC或FRET方式,在目的细胞内进行两个蛋白的相互作用验证。
一、原理如下:
BiFC:Bimolecular Fluorescence Complementation,将GFP或变体YFP/Venus荧光蛋白,分拆成两段蛋白,分别与目的蛋白融合表达。目标蛋白分子互作后,两段荧光蛋白被拉近,从而恢复荧光特性。
FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer,将激发光和发射光相近的荧光蛋白对EGFP和mCherry,分别和目的蛋白融合表达。目标蛋白分子互作后,荧光蛋白被拉近,用EGFP激发光能激发mCherry发生荧光。互作越强,mCherry发光信号越强。
二、试验如下:
(1)构建融合表达载体:把目的蛋白A(PA)和Venus的N段融合,把目标蛋白B(PB)和Venus的C段融合,构建BIFC双载体;或把PA和ECYP融合,把PB和Venus融合,构建FRET双载体。
(2)融合载体共转染细胞系,检测体内BIFC荧光互补回复情况,或FRET能量偏振情况,直接可视化验证两个目标蛋白是否在细胞内发生直接相互作用。
三、优劣势比较
优势:可视化直观,严谨增色,项目简便(直接定制载体或慢病毒即可,BIFC只需普通荧光显微镜即可观察结果;FRET则需要共聚焦显微镜才能观察能量偏振情况)。
劣势:BIFC和FRET要求一定的空间位置,才能发生BIFC荧光回复,或FRET荧光能量偏振,存在假阴性可能。细胞内蛋白相互作用,但因荧光分子空间位阻,不能有效发生BIFC或FRET,出现假阴性结果;或融合荧光蛋白阻挡了目的蛋白互作,出现假阴性结果。
四、应用扩展:
(1)潜在互作蛋白验证:可以选择BiFC和CoIP的方式进行验证。只要有一个有互作信号,即可证明两个蛋白在细胞内存在互作。
(2)互作机制严谨性研究:初步验证的互作蛋白,具体是哪些结构域发生了互作,可用通过截断蛋白的方式,快速检测互作区段。(构建载体时,可添加Flag或HA小肽,可进一步用来做IP验证)。
广州基云生物专注互作机制研究,有关蛋白互作BIFC/FRET验证相关问题,欢迎评论回复或后台留言讨论。
一、原理如下:
BiFC:Bimolecular Fluorescence Complementation,将GFP或变体YFP/Venus荧光蛋白,分拆成两段蛋白,分别与目的蛋白融合表达。目标蛋白分子互作后,两段荧光蛋白被拉近,从而恢复荧光特性。
FRET:Fluorescence Resonance Energy Transfer,将激发光和发射光相近的荧光蛋白对EGFP和mCherry,分别和目的蛋白融合表达。目标蛋白分子互作后,荧光蛋白被拉近,用EGFP激发光能激发mCherry发生荧光。互作越强,mCherry发光信号越强。
二、试验如下:
(1)构建融合表达载体:把目的蛋白A(PA)和Venus的N段融合,把目标蛋白B(PB)和Venus的C段融合,构建BIFC双载体;或把PA和ECYP融合,把PB和Venus融合,构建FRET双载体。
(2)融合载体共转染细胞系,检测体内BIFC荧光互补回复情况,或FRET能量偏振情况,直接可视化验证两个目标蛋白是否在细胞内发生直接相互作用。
三、优劣势比较
优势:可视化直观,严谨增色,项目简便(直接定制载体或慢病毒即可,BIFC只需普通荧光显微镜即可观察结果;FRET则需要共聚焦显微镜才能观察能量偏振情况)。
劣势:BIFC和FRET要求一定的空间位置,才能发生BIFC荧光回复,或FRET荧光能量偏振,存在假阴性可能。细胞内蛋白相互作用,但因荧光分子空间位阻,不能有效发生BIFC或FRET,出现假阴性结果;或融合荧光蛋白阻挡了目的蛋白互作,出现假阴性结果。
四、应用扩展:
(1)潜在互作蛋白验证:可以选择BiFC和CoIP的方式进行验证。只要有一个有互作信号,即可证明两个蛋白在细胞内存在互作。
(2)互作机制严谨性研究:初步验证的互作蛋白,具体是哪些结构域发生了互作,可用通过截断蛋白的方式,快速检测互作区段。(构建载体时,可添加Flag或HA小肽,可进一步用来做IP验证)。
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