大家好，今天跟大家分享这篇题为 Sequential Inhibition of PARP and BET as a Rational Thera peutic Strategy for Gliobla stoma（顺序抑制PARP和BET作为胶质母细胞瘤的合理治疗策略）为了全面探究BETiBirabresib对GBM细胞的生物学影响，研究者将经Birabresib处理的U87细胞进行了RNA-Seq和定量蛋白质组测序。
01
研究背景
PARP 抑制剂 （PARPi） 在治疗胶质母细胞瘤 （GBM） 方面具有广阔的前景。然而，不利影响限制了其广泛应用。通过无偏倚的转录组学和蛋白质组学测序，发现 BET 抑制剂 （BETi） Birabresib 深刻地改变了 GBM 细胞中 DNA 复制和细胞周期进程的过程，超出了先前报道的 BET 抑制对同源重组修复的影响。
通过使用已建立的GBM细胞系和患者来源的原代GBM细胞的体外实验，以及斑马鱼和裸鼠的体内原位移植肿瘤实验，证明同时给药PARPi和BETi可以协同抑制GBM。有趣的是，观察到 DNA 损伤在停止 PARPi 单药治疗后仍然存在，这意味着 PARPi 和 BETi 的序贯给药可以在降低毒性的同时保持抗肿瘤功效。
在基线复制应激升高的GBM细胞中，序贯方案表现出与同步治疗相当的疗效，保护基线复制应激较低的正常神经胶质细胞免受DNA毒性和随后的死亡。这项研究提供了令人信服的临床前证据，支持开发专注于 GBM 治疗的 PARPi 的创新药物给药策略。
见图一
Birabresib治疗可改变基因和蛋白质表达。用Birabresib（0.5 μm）或DMSO（对照）处理U87细胞24小时，并进行RNA-Seq和定量蛋白质组学测序。
图一
（A） 火山图显示全局基因表达，基因表达的对数倍数变化和调整后的 p 值。水平虚线表示调整后的 p 值为 0.05。
（B） 显示差异表达基因的热图，将 FPKM 值转换为 Z 分数并进行聚类分析。
（C） 气泡图，说明映射到 GO（基因本体）通路的差异表达基因的富集，包括 GO-BP（生物过程）、GO-BP（生物过程）和 GO-CC（细胞成分）。调整后的 p 值由颜色变化表示，气泡的大小对应于每个项中的基因数量。
（D） 圆形基因概念网络图，显示富集的 KEGG 通路和基因网络。每个通路的气泡大小对应于相关基因的数量，不同的通路用不同的颜色表示。基因表达的对数倍数变化由颜色变化来描述。
（E） 散点图显示映射到 KEGG 通路的差异表达基因的基因集富集分析 （GSEA），包括归一化富集评分和调整后的 p 值。水平虚线表示调整后的 p 值为 0.05。
（F） 条形图显示 KEGG 基因集富集分析中的选定通路，包括富集评分和基因排名。基因表达的对数倍变化由颜色变化表示，排名靠前的基因在右侧被放大。
（G） 火山图，说明了映射到 KEGG 通路的基因的基因集变异分析，包括富集评分和调整后的 p 值的对数倍数变化。水平虚线表示调整后的 p 值为 0.05。
（H） 比较转录组和蛋白质组对数倍数变化值的九象限图。调整后的 p 值为 <0.05 的颜色编码基因（蛋白质组学分析每组 n = 3;RNA-seq的n = 3）。
（I） 与DNA复制和细胞周期相关的九种反应组通路的蛋白质-蛋白质相互作用网络图。每种蛋白质的通路隶属关系反映在节点边框的颜色中，每种颜色对应于特定的通路。蛋白质表达的对数倍变化由顺时针递减方式的颜色变化表示。调整后的蛋白质表达 P 值由标签颜色变化表示。蛋白质相互作用的综合分数由边缘的厚度和透明度表示。
见图二
Birabresib 和 PARP 抑制剂对 GBM 的协同抑制。
图二
（A） 在已建立的 GBM 细胞系（U251 和 U87）和患者来源的原代 GBM 细胞系（SHG140 和 DT001）中进行 ZIP 模型协同分析。用浓度递增的奥拉帕尼/鲁卡帕尼和比拉布雷西处理GBM细胞96 h，然后计算肿瘤细胞生长的抑制率。结果以与剂量反应矩阵的 ZIP 协同评分的形式呈现。
（B） 用 Birabresib 和/或 Rucaparib 处理 72 小时的 GBM 细胞的克隆形成测定，允许其恢复 10-15 天，然后进行结晶紫染色。
（C） 定量 B），用 1% SDS 孵育 3 小时后测量 570 nm 处的光吸光度。细胞存活率（%）表示为对照组的百分比;置信区间是用CalcuSyn计算的。CI ≤ 0.9 代表协同作用，0.9 < CI ≤ 1.1 代表可加性，CI > 1.1 代表拮抗作用。
（D，E）用0.5 μ mBirabresib和/或20 μmRucaparib处理48小时的GBM细胞的细胞凋亡测定。通过膜联蛋白 V/PI 染色检测细胞凋亡。FACS定量总凋亡细胞群，包括膜联蛋白V+/PI−早期凋亡细胞和膜联蛋白V+/PI+晚期凋亡细胞。
（F）用Birabresib和/或Rucaparib处理48小时的U251和U87细胞中裂解的Caspase-3和PARP的蛋白质印迹分析。
（G）原位斑马鱼模型中胚胎的荧光图像。移植 50–100 个 U87-RFP 细胞后，将注射的胚胎转移到含有药物的 96 孔板中并孵育 96 小时。在荧光显微镜下对胚胎进行成像以评估肿瘤生长。比例尺，100μm。
（H）不同组的荧光强度，在实验终点（96小时）确定，以积分密度的倍数变化表示。
见图三
Birabresib 和 PARPi 改变细胞周期进程和 DNA 损伤修复。
图三
（A） 用 DMSO、0.5 μm Birabresib、20 μm Rucaparib 或两者的组合处理 GBM 细胞 24 小时，然后进行 pH3 和 PI 流式细胞术分析。
（B） 通过蛋白质印迹法检测指示的细胞周期检查点蛋白的表达。
（C，D） GBM 细胞在用 Rucaparib、Birabresib 或两者的组合处理后进行 γ-H2AX 和 RAD51 病灶测定。具有阳性 γ-H2AX/RAD51 信号（每个细胞超过 5 个病灶）的 U251 和 U87 细胞的代表性图像和定量。比例尺，20μm。
（E，F） DR-GFP 报告基因测定评估了 Birabresib 和 Rucaparib 对 U251 和 U87 细胞 HR 修复效率的影响。相对 HR 效率表示为控制的百分比。
（G） 用 BETi（0.02μ m Birabresib 或 0.01μ m JQ1）和 PARPi（1 μm Rucaparib 或 1μ m Olaparib）处理的 U251 细胞的 γ-H2AX 病灶测定。使用免疫荧光评估γ-H2AX病灶的形成和消退。比例尺，50μm。
（ H） 在每个时间点显示 γ-H2AX 阳性细胞的百分比（每个细胞> 5 个病灶）。显示代表性图像。
（I） 用 DMSO、Birabresib 和 Rucaparib、顺序组合或并发组合处理细胞，然后进行克隆形成测定。
（J） I） 的定量，在用 1% SDS 孵育 3 小时后测量 570 nm 处的光吸光度。细胞存活率（%）表示为对照的百分比。
见图四
Rucaparib 和 Birabresib 序贯治疗的体外疗效。
图四
（A） 用 DMSO、0.5 μm Birabresib、20 μm Rucaparib 处理 GBM 细胞，顺序和同时处理，然后进行 pH3 和 PI 流式细胞术分析。
（B）GBM细胞按（A）处理并进行彗星测定。DNA 损伤被量化为尾部 DNA 的百分比。
（C） 按 （A） 处理的 U251 细胞的代表性图像，对 γ-H2AX、pH3 和 DAPI 进行染色。比例尺，50μm。
D） U251 细胞的代表性图像，如 （A） 所述，对裂解的半胱天冬酶-3、pH3 和 DAPI 进行染色。比例尺，50μm。
（E） 对 （C） 和 （D） 的定量分析来自三个独立实验中的每一个的五张照片。
（F，G）按（A）处理并进行DNA纤维分析的GBM细胞的代表性图像。比例尺，5 μm。平均货叉速度 （kb min−1） 表示。图表显示为三个独立实验的平均± SEM;使用双尾未配对学生 t 检验确定 p 值;p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。
见图五
通过 rucaparib 和 birabresib 的序贯治疗观察到的细胞毒性降低。
图五
（A） 用 DMSO、Birabresib、Rucaparib、序贯和并行处理（如图 3I 所示）处理正常神经胶质细胞，然后进行克隆形成测定。
（B）定量（A），用1%SDS孵育3小时后测量570nm处的光吸光度。细胞存活率（%）表示为对照的百分比。
（C） 用 DMSO、Birabresib、Rucaparib、序贯和并行处理（如图 4A 所示）处理正常神经胶质细胞，并进行 pH3 和 PI 流式细胞术分析。
（D）正常神经胶质细胞如图4A所示处理并进行彗星测定。DNA 损伤被量化为尾部 DNA 的百分比。
（E，F）将正常神经胶质细胞如图4A所示，在50 μ m胡或不50m处理24小时，并进行DNA纤维分析。比例尺，5 μm。平均货叉速度 （kb min−1） 表示。
（G，H）如图4A所示，用或不用50 μm胡处理正常神经胶质细胞24小时，并进行γ-H 2 AX病灶分析。比例尺，5 μm。图表显示为三个独立实验的平均± SEM;使用双尾未配对学生 t 检验确定 p 值;p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。
见图六
Rucaparib和Birabresib的序贯给药可达到卓越的治疗效果。
图六
（A）裸鼠异种移植模型小鼠的生物发光图像。在小鼠颅内接种U87-Luc细胞。通过体内生物发光成像监测荧光素酶表达的定位和强度。用载体治疗后，Rucaparib（10mg kg−1）、比拉布雷西布（50毫克千克−1）、并发（Rucaparib + Birabresib）或顺序（Rucaparib 7 天 + Birabresib 7 天）持续 21 天 （n = 6），使用生物发光成像系统评估动物。显示了在指定时间点获得的代表性生物发光图像。
（B）数据显示为每个肿瘤的生长曲线。
（C） 使用成像系统确定第 0、7、14 和 21 天的相对辐射，代表肿瘤大小。第 21 天的值用于对任何两组之间的差异进行统计分析。
（D） 治疗 21 天内的体重曲线。
（E） 在第 21 天，从每组小鼠中收集外周血以测量血红蛋白水平。
（F） 车辆、车辆、Rucaparib 的 Kaplan-Meier 生存曲线 （10 mg kg−1，ip），Birabresib（50mg kg−1、腹腔内）、并发组（Rucaparib + Birabresib）和序贯组（Rucaparib 7 天 + Birabresib 7 天）。
（G） 治疗后颅内 U87 小鼠异种移植物的苏木精和曙红染色切片（原始放大倍数 20×）。
（H） U87异种移植物肿瘤组织中γ-H2AX的代表性免疫组化染色。比例尺，50μm。
（I）统计量化（H），每个点代表五个图像的平均值。
02
研究结论
总之，我们的研究利用了 PARPi 的残余效应，证明 BETi 的顺序给药会加剧 GBM 的复制应激，导致随后的 DNA 损伤。该策略利用了GBM和正常神经胶质细胞之间基线复制应激的固有差异，使正常神经胶质细胞免受重大影响。同时，BETi 阻碍 HR 修复，从而阻碍 PARPi 诱导的 DSB 的修复，导致 GBM 细胞死亡。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
PARP 抑制剂 （PARPi） 在治疗胶质母细胞瘤 （GBM） 方面具有广阔的前景。然而，不利影响限制了其广泛应用。通过无偏倚的转录组学和蛋白质组学测序，发现 BET 抑制剂 （BETi） Birabresib 深刻地改变了 GBM 细胞中 DNA 复制和细胞周期进程的过程，超出了先前报道的 BET 抑制对同源重组修复的影响。
通过使用已建立的GBM细胞系和患者来源的原代GBM细胞的体外实验，以及斑马鱼和裸鼠的体内原位移植肿瘤实验，证明同时给药PARPi和BETi可以协同抑制GBM。有趣的是，观察到 DNA 损伤在停止 PARPi 单药治疗后仍然存在，这意味着 PARPi 和 BETi 的序贯给药可以在降低毒性的同时保持抗肿瘤功效。
在基线复制应激升高的GBM细胞中，序贯方案表现出与同步治疗相当的疗效，保护基线复制应激较低的正常神经胶质细胞免受DNA毒性和随后的死亡。这项研究提供了令人信服的临床前证据，支持开发专注于 GBM 治疗的 PARPi 的创新药物给药策略。
见图一
Birabresib治疗可改变基因和蛋白质表达。用Birabresib（0.5 μm）或DMSO（对照）处理U87细胞24小时，并进行RNA-Seq和定量蛋白质组学测序。
图一
（A） 火山图显示全局基因表达，基因表达的对数倍数变化和调整后的 p 值。水平虚线表示调整后的 p 值为 0.05。
（B） 显示差异表达基因的热图，将 FPKM 值转换为 Z 分数并进行聚类分析。
（C） 气泡图，说明映射到 GO（基因本体）通路的差异表达基因的富集，包括 GO-BP（生物过程）、GO-BP（生物过程）和 GO-CC（细胞成分）。调整后的 p 值由颜色变化表示，气泡的大小对应于每个项中的基因数量。
（D） 圆形基因概念网络图，显示富集的 KEGG 通路和基因网络。每个通路的气泡大小对应于相关基因的数量，不同的通路用不同的颜色表示。基因表达的对数倍数变化由颜色变化来描述。
（E） 散点图显示映射到 KEGG 通路的差异表达基因的基因集富集分析 （GSEA），包括归一化富集评分和调整后的 p 值。水平虚线表示调整后的 p 值为 0.05。
（F） 条形图显示 KEGG 基因集富集分析中的选定通路，包括富集评分和基因排名。基因表达的对数倍变化由颜色变化表示，排名靠前的基因在右侧被放大。
（G） 火山图，说明了映射到 KEGG 通路的基因的基因集变异分析，包括富集评分和调整后的 p 值的对数倍数变化。水平虚线表示调整后的 p 值为 0.05。
（H） 比较转录组和蛋白质组对数倍数变化值的九象限图。调整后的 p 值为 <0.05 的颜色编码基因（蛋白质组学分析每组 n = 3;RNA-seq的n = 3）。
（I） 与DNA复制和细胞周期相关的九种反应组通路的蛋白质-蛋白质相互作用网络图。每种蛋白质的通路隶属关系反映在节点边框的颜色中，每种颜色对应于特定的通路。蛋白质表达的对数倍变化由顺时针递减方式的颜色变化表示。调整后的蛋白质表达 P 值由标签颜色变化表示。蛋白质相互作用的综合分数由边缘的厚度和透明度表示。
见图二
Birabresib 和 PARP 抑制剂对 GBM 的协同抑制。
图二
（A） 在已建立的 GBM 细胞系（U251 和 U87）和患者来源的原代 GBM 细胞系（SHG140 和 DT001）中进行 ZIP 模型协同分析。用浓度递增的奥拉帕尼/鲁卡帕尼和比拉布雷西处理GBM细胞96 h，然后计算肿瘤细胞生长的抑制率。结果以与剂量反应矩阵的 ZIP 协同评分的形式呈现。
（B） 用 Birabresib 和/或 Rucaparib 处理 72 小时的 GBM 细胞的克隆形成测定，允许其恢复 10-15 天，然后进行结晶紫染色。
（C） 定量 B），用 1% SDS 孵育 3 小时后测量 570 nm 处的光吸光度。细胞存活率（%）表示为对照组的百分比;置信区间是用CalcuSyn计算的。CI ≤ 0.9 代表协同作用，0.9 < CI ≤ 1.1 代表可加性，CI > 1.1 代表拮抗作用。
（D，E）用0.5 μ mBirabresib和/或20 μmRucaparib处理48小时的GBM细胞的细胞凋亡测定。通过膜联蛋白 V/PI 染色检测细胞凋亡。FACS定量总凋亡细胞群，包括膜联蛋白V+/PI−早期凋亡细胞和膜联蛋白V+/PI+晚期凋亡细胞。
（F）用Birabresib和/或Rucaparib处理48小时的U251和U87细胞中裂解的Caspase-3和PARP的蛋白质印迹分析。
（G）原位斑马鱼模型中胚胎的荧光图像。移植 50–100 个 U87-RFP 细胞后，将注射的胚胎转移到含有药物的 96 孔板中并孵育 96 小时。在荧光显微镜下对胚胎进行成像以评估肿瘤生长。比例尺，100μm。
（H）不同组的荧光强度，在实验终点（96小时）确定，以积分密度的倍数变化表示。
见图三
Birabresib 和 PARPi 改变细胞周期进程和 DNA 损伤修复。
图三
（A） 用 DMSO、0.5 μm Birabresib、20 μm Rucaparib 或两者的组合处理 GBM 细胞 24 小时，然后进行 pH3 和 PI 流式细胞术分析。
（B） 通过蛋白质印迹法检测指示的细胞周期检查点蛋白的表达。
（C，D） GBM 细胞在用 Rucaparib、Birabresib 或两者的组合处理后进行 γ-H2AX 和 RAD51 病灶测定。具有阳性 γ-H2AX/RAD51 信号（每个细胞超过 5 个病灶）的 U251 和 U87 细胞的代表性图像和定量。比例尺，20μm。
（E，F） DR-GFP 报告基因测定评估了 Birabresib 和 Rucaparib 对 U251 和 U87 细胞 HR 修复效率的影响。相对 HR 效率表示为控制的百分比。
（G） 用 BETi（0.02μ m Birabresib 或 0.01μ m JQ1）和 PARPi（1 μm Rucaparib 或 1μ m Olaparib）处理的 U251 细胞的 γ-H2AX 病灶测定。使用免疫荧光评估γ-H2AX病灶的形成和消退。比例尺，50μm。
（ H） 在每个时间点显示 γ-H2AX 阳性细胞的百分比（每个细胞> 5 个病灶）。显示代表性图像。
（I） 用 DMSO、Birabresib 和 Rucaparib、顺序组合或并发组合处理细胞，然后进行克隆形成测定。
（J） I） 的定量，在用 1% SDS 孵育 3 小时后测量 570 nm 处的光吸光度。细胞存活率（%）表示为对照的百分比。
见图四
Rucaparib 和 Birabresib 序贯治疗的体外疗效。
图四
（A） 用 DMSO、0.5 μm Birabresib、20 μm Rucaparib 处理 GBM 细胞，顺序和同时处理，然后进行 pH3 和 PI 流式细胞术分析。
（B）GBM细胞按（A）处理并进行彗星测定。DNA 损伤被量化为尾部 DNA 的百分比。
（C） 按 （A） 处理的 U251 细胞的代表性图像，对 γ-H2AX、pH3 和 DAPI 进行染色。比例尺，50μm。
D） U251 细胞的代表性图像，如 （A） 所述，对裂解的半胱天冬酶-3、pH3 和 DAPI 进行染色。比例尺，50μm。
（E） 对 （C） 和 （D） 的定量分析来自三个独立实验中的每一个的五张照片。
（F，G）按（A）处理并进行DNA纤维分析的GBM细胞的代表性图像。比例尺，5 μm。平均货叉速度 （kb min−1） 表示。图表显示为三个独立实验的平均± SEM;使用双尾未配对学生 t 检验确定 p 值;p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。
见图五
通过 rucaparib 和 birabresib 的序贯治疗观察到的细胞毒性降低。
图五
（A） 用 DMSO、Birabresib、Rucaparib、序贯和并行处理（如图 3I 所示）处理正常神经胶质细胞，然后进行克隆形成测定。
（B）定量（A），用1%SDS孵育3小时后测量570nm处的光吸光度。细胞存活率（%）表示为对照的百分比。
（C） 用 DMSO、Birabresib、Rucaparib、序贯和并行处理（如图 4A 所示）处理正常神经胶质细胞，并进行 pH3 和 PI 流式细胞术分析。
（D）正常神经胶质细胞如图4A所示处理并进行彗星测定。DNA 损伤被量化为尾部 DNA 的百分比。
（E，F）将正常神经胶质细胞如图4A所示，在50 μ m胡或不50m处理24小时，并进行DNA纤维分析。比例尺，5 μm。平均货叉速度 （kb min−1） 表示。
（G，H）如图4A所示，用或不用50 μm胡处理正常神经胶质细胞24小时，并进行γ-H 2 AX病灶分析。比例尺，5 μm。图表显示为三个独立实验的平均± SEM;使用双尾未配对学生 t 检验确定 p 值;p < 0.01;p < 0.001;p < 0.0001。
见图六
Rucaparib和Birabresib的序贯给药可达到卓越的治疗效果。
图六
（A）裸鼠异种移植模型小鼠的生物发光图像。在小鼠颅内接种U87-Luc细胞。通过体内生物发光成像监测荧光素酶表达的定位和强度。用载体治疗后，Rucaparib（10mg kg−1）、比拉布雷西布（50毫克千克−1）、并发（Rucaparib + Birabresib）或顺序（Rucaparib 7 天 + Birabresib 7 天）持续 21 天 （n = 6），使用生物发光成像系统评估动物。显示了在指定时间点获得的代表性生物发光图像。
（B）数据显示为每个肿瘤的生长曲线。
（C） 使用成像系统确定第 0、7、14 和 21 天的相对辐射，代表肿瘤大小。第 21 天的值用于对任何两组之间的差异进行统计分析。
（D） 治疗 21 天内的体重曲线。
（E） 在第 21 天，从每组小鼠中收集外周血以测量血红蛋白水平。
（F） 车辆、车辆、Rucaparib 的 Kaplan-Meier 生存曲线 （10 mg kg−1，ip），Birabresib（50mg kg−1、腹腔内）、并发组（Rucaparib + Birabresib）和序贯组（Rucaparib 7 天 + Birabresib 7 天）。
（G） 治疗后颅内 U87 小鼠异种移植物的苏木精和曙红染色切片（原始放大倍数 20×）。
（H） U87异种移植物肿瘤组织中γ-H2AX的代表性免疫组化染色。比例尺，50μm。
（I）统计量化（H），每个点代表五个图像的平均值。
02
研究结论
总之，我们的研究利用了 PARPi 的残余效应，证明 BETi 的顺序给药会加剧 GBM 的复制应激，导致随后的 DNA 损伤。该策略利用了GBM和正常神经胶质细胞之间基线复制应激的固有差异，使正常神经胶质细胞免受重大影响。同时，BETi 阻碍 HR 修复，从而阻碍 PARPi 诱导的 DSB 的修复，导致 GBM 细胞死亡。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
