怀着激动的心情，配了几天试剂，各种配TBST，TG，电转液，PBS，BSA~~
学着配胶SDS-PAGE，一般都是10%的，10孔就够用了。坑爹的是配方表上的浓缩胶配方不准确，用量都要乘2。灌胶的时候，尽量轻缓，不要产生气泡，不过也别太慢的说。插完梳子之后，记得补胶。学会配胶很重要嗯呢。
上样动作慢慢的，担心加错了加漏的说，特别是加第一个样的时候，还要仔细找找加样孔在哪=。=
对了，把胶板放入槽里面的时候，要注意下面的加热线上面没有气泡。
还有就是加样时，只用10ul的枪！！！

昨天配胶没配好，被师傅训了，不开森=。=

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
有三种效应的说：分子筛效应，电荷效应，堆积效应。
要好好配胶啊，怎么不长记性=。=
丙烯酰胺 具有很强的神经毒素，可以通过皮肤吸收。
TEMED 也有毒。
真是配个胶好危险！！记得戴口罩。

1——当水【我这里用的无水乙醇，还可以消泡沫】和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。【一般都是用的12%的胶】
2——按前面方法配 5.1％的浓缩胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平【斜着插梳子可以避免产生一些气泡再梳齿下面】。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
3——用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。【我放的玻璃板】）
4——测完蛋白含量后，计算含 50μg 蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至 0.5ml 离心管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（上样总体积一般不超过 15μl【根据计算的上样体积加】，加样孔的最大限度可加 20μl 样品【10孔的上样量上限好像是30uL】。）上样前要将样品于沸水中煮 5min 【我一般煮10min】使蛋白变性。
5——加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品【只用10uL的枪加样】，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3 次，【直接换枪头】以免交叉污染。

上样跑胶：
1. 先放好板，倾斜放入，摇晃，使底部加热线没有气泡！！
2. 加入TG（电泳液）到合适的量。
3. 点样: 比如三块胶，注意用marker的位置区分！！！点样时，只能用10ul 的枪进行点样！！！点样时，细心，别加量加错了！！恍恍惚惚，好像只加了一次7.5ul，用针吸出，重新加样。
3. 恒压80V，marker跑开后换电压120V。
切胶；电泳槽取出后水冲洗，选择目的条带，切较大范围的胶。切完后加水，保持胶的湿润，否则胶会翘起来。【根据marker切胶】
量胶：给胶编号，分别量取长宽，并记录。
剪PVDF膜：根据量取的长宽，裁剪相应的膜。编号后剪角！！！！【最近师傅都只让我贴膜，请叫我贴膜boy_(:зゝ∠)_】
贴膜：把pv膜用甲醇浸透约2min，再用电转液浸湿。弄好三明治板（下面三层棉，两层滤纸）用镊子取胶在电转液中浸一下，尽量用镊子夹胶的头部或尾部，放在三明治板上，再贴上pv膜，要没有气泡在里面！！！在放两层滤纸，在放两层棉，夹紧后关上。
三明治板制作：黑色板上三层棉，两层滤纸，胶，贴膜，赶气泡，两层滤纸，两层棉。白色板夹紧，关闭。

封闭：电转完成后，放在PBS润洗一下，就拿起来放在条形盒里，小条带就加2ml的5%脱脂牛奶。大条带放在自制的封闭膜中。摇床封闭2h。
一抗：用1%脱脂牛奶的TBST稀释相应的抗体，内参稀释比例为1:1000 ，室温摇床一小时后，4度孵育过夜。

看到这张图，我忍不住笑了，23333333333333
简直是艺术！！！

眨眼一个月了啊，淡淡的忧桑，就快要离开，有点舍不得师傅啊，一起玩的小伙伴们啊。

年年岁岁花相似，岁岁年年人不同。

先来了个女生，不过不是我们组，昨天又来个男生在我们组，高兴又不高兴 =。=
诶诶诶，谁叫我要走了呢，萌萌哒的师傅终于还是有人帮忙了。
希望这周快点带会新来的，是不是要求太高了，毕竟我来了一个月左右才搞清白咋做实验【智障_(:зゝ∠)_】。

一个人可以逃避世间的一切魔鬼，但唯有一个是他永远无法摆脱的，那就是懦弱的自己。

拜拜，师傅

伤离别，不喜欢热闹，因为热闹以后便是寂寥--

楼主，有没有转膜的经验啊，最近转膜老是转过。好忧桑

请问一下楼主，我用鼠源的细胞做WB只能是买鼠源的一抗吗？还是说我只要保证一抗二抗物种相同就行？