什么是酶切位点，保护碱基怎么加，kozak序列是什么？ 了解这些之后才能设计出能实际应用的引物序列。 1⃣酶切位点：被特异性内切酶识别的特异性核苷酸序列，从而被切割的位点。 2⃣保护碱基：限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，还需要占用两边若干碱基，这些碱基对内切酶的稳定结合并发挥酶切作用有很大影响，因此称为保护碱基。可以百度对应的酶切位点的保护碱基 3⃣kozak序列：该女科学家研究发现真核生物中起始密码子两端序列为：GCCACCAUGG时翻译效率最高，被称为kozak序列。 ✔️上游引物的组成 5'保护碱基+酶切位点+kozak序列+ATG（起始密码子）+目的基因序列（18-28bp） 控制Tm在60℃左右。 ✔️下游引物的组成 5'保护碱基+酶切位点+终止密码子+目的基因序列。有终止密码子需要先去掉终止密码子（18-30bp） 注意设计出来后要反向互补 控制Tm在60℃左右。 如果需要构建质粒表达载体则不需要加终止密码子 🔍在SNAPGENE上的具体操作为 1.点开序列图谱 2.选中18bp—28bp左右的碱基看一下Tm值60℃左右及GC含量（40%-60%） 3.分别添加酶切位点、kozak序列及保护碱基。 4.下游先去掉终止密码子再添加酶切位点和保护碱基 5.添加完后选择模拟PCR检测是否成功 ⭐️PS：一般扩增一次比较准确的DNA长度最长为1000bp左右，太长就无法测通，因此比较长的基因需要分段扩增哦[赞R] #PCR #引物设计