大神们帮忙看看吧 最近在构建重组质粒 采用的是同源重组的方法 载体线性化方法采用反向PCR 插入片段扩增时引物带上同源臂
1. 这是我设计的反向引物

2.这是我设计的扩增目的基因的引物


3.这是我重组后的测序结果

问题就是目的片段完全没有连接上去，而是插入了一些反向PCR 引物位置的小片段，我个人感觉应该是载体线性化过程出现了问题，但是线性化跑胶条带特异性又很好，没有杂带，如下图：

所以请问各位大神有遇到过这种情况吗，是真不知道什么原因导致的。
我个人猜测是不是我反向PCR引物设计的问题，正反向引物靠得太近了，而且重组后的片段也都是引物那个位置的片段，所以不知道是不是这个原因，其他的真想不出来了，求解。