糖尿病肾病（DKD）是一种普遍存在的慢性肾脏疾病，是终末期肾病进展的主要原因。足细胞是覆盖GBM外表面的高度分化的上皮细胞，对于维持GBM的完整性至关重要。因此，足细胞损伤的程度通常用来评估DKD的进展。此外，足细胞中的炎症积聚与足细胞损伤的加重密切相关。
2024年6月，温州医科大学梁广团队在Nat Commun（IF=14.7）上，发表“Podocyte OTUD5 alleviates diabetic kidney disease through deubiquitinating TAK1 and reducing podocyte inflammation and injury”的研究成果。揭示了去泛素化酶OTUD5在足细胞损伤和糖尿病肾病中的作用机制。
Highlights如下：
1）OTUD5在糖尿病小鼠足细胞中的表达减少。
2）足细胞特异性OTUD5敲除加重足细胞损伤和DKD。
3）机制上，OTUD5通过其活性位点C224促进TAK1 K158位点发生K63连接的去泛素化，随后阻止TAK1的磷酸化并减少足细胞的下游炎症反应，突出了OTUD5作为DKD治疗靶点的潜力。临床相关性：OTUD5在糖尿病小鼠足细胞中的表达减少。功能研究：足细胞特异性OTUD5敲除或过表达能加重或抑制足细胞损伤和DKD，TAK1抑制剂缓解OTUD5敲除小鼠的肾损伤。
机制研究：
（1）鉴定TAK1为OTUD5潜在的底物蛋白
第一步，初步确定OTUD5潜在的底物蛋白作为去泛素化酶（DUB），OTUD5通过去泛素化底物蛋白起作用。利用IP-MS鉴定潜在的互作蛋白（图1a）。质谱鉴定的前15个潜在结合蛋白中，TAK1被证实在足细胞炎症和DKD进展中具有关键的调节作用（图1b）。因此，假设OTUD5通过去泛素化TAK1在足细胞中负调控炎症和损伤。
第二步，确定TAK1与OTUD5相互作用
内源性Co-IP实验证实，OTUD5与TAK1在细胞和小鼠肾组织均存在相互作用（图1c-d）。同时，外源性Co-IP实验也显示，OTUD5与TAK1相互作用（图1e）。
图1 TAK1与OTUD5相互作用（Ref. Fig 4/S4）
第三步，OTUD5诱导TAK1 K63连接的去泛素化
Co-IP实验分析显示，OTUD5过表达，降低TAK1的多泛素化水平（图2a）。为了确定TAK1泛素化连接的方式，构建Ub-WT、Ub-K48、Ub-K63和TAK1载体进行Co-IP分析，发现OTUD5降低TAK1的K63连接的泛素化，而不是K48连接的泛素化（图2b）。
第四步，OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化
研究表明，OTU5中的半胱氨酸224残基(C224)为脱泛素活性的必要位点。Co-IP分析显示，与野生型OTUD5相比，催化失活的OTUD5 C224S突变体可以正常与TAK1相互作用（图2c）；但未能从TAK1中去除K63连接的泛素分子（图2d）。表明OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化。
第五步，TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点
迄今为止，TAK1蛋白中的四个赖氨酸(Lys)残基K34、K158、K209和K562已被确定为K63连接的多泛素化的潜在位点（图2e）。因此，为了探索哪些赖氨酸残基泛素化可以被OTUD5去除，构建了TAK1位点突变体，包括K34R、K158R、K209R和K562R。Co-IP分析显示，K158R突变体消除了OTUD5介导的去泛素化（图2f）。表明TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点。
综上所述，OTUD5通过其活性位点C224降低k63连接的TAK1 K158位点的多泛素化。
图2 OTUD5通过其活性位点C224降低k63连接的TAK1 K158位点的多泛素化（Ref. Fig 4/S4）
（3）OTUD5负调控TAK1激活
第一步，OTUD5共同负调控TAK1-MAPK激活
WB检测证实，OTUD5过表达显著抑制HG/ pa诱导的足细胞TAK1磷酸化，但不改变TAK1总蛋白水平（图3a）。敲低OTUD5则相反（图3b）。MAPK通路是TAK1激活的主要下游信号，包括三个亚家族：JNK、ERK和p38。研究结果表明，在HG/ pa处理的足细胞中，OTUD5过表达也会抑制ERK、P38和JNK的激活，但OTUD5敲低会加剧ERK、P38和JNK的激活（图3c-d）。在HG/PA处理下，OTUD5共同负调控TAK1-MAPK激活。
第二步， OTUD5抑制TAK1与TAB2相互作用
TAK1磷酸化需要一个上游的激酶TAB2。据研究显示K63连接的TAK1多泛素化促进TAK1/TAB2复合物的形成，导致TAK1磷酸化。本研究中，OTUD5去除了TAK1的K63连接的泛素化，因此假设OTUD5可能会阻碍TAK1-TAB2的相互作用。Co-IP实验发现，OTUD5的过表达减少了TAK1与TAB2相互作用，而催化失活的突变体OTUD5-C224S则不能（图3e）。此外，在HG/ pa处理的足细胞中，OTUD5抑制TAK1-MAPK通路的激活，但OTUD5-C224S突变体则不能（图3f）。
第三步，OTUD5通过在K158位点阻断TAK1-TAB2相互作用来抑制TAK1的激活
OTUD5介导的TAK1失活是否依赖于TAK1在K158位点的去泛素化？
Co-IP分析显示，当TAK1中的K158突变为R残基时，TAK1与TAB2的相互作用减少，而OTUD5不能进一步影响TAK1与TAB2的相互作用（图3g）。同样，TAK1 K158R突变抑制TAK1- mapk在HG/PA刺激下的激活（图3h）。表明OTUD5通过在K158位点阻断TAK1-TAB2相互作用来抑制TAK1的激活。
图3 OTUD5负调控TAK1激活（Ref. Fig 5）
结论：该研究通过对高浓度葡萄糖和棕榈酸（HG/PA）处理的足细胞进行RNA测序，发现OTUD5显著下调。功能上，通过OTUD5过表达或TAK1抑制剂治疗，减轻足细胞损伤和DKD。机制上，OTUD5通过其活性位点C224促进TAK1 K158位点发生K63连接的去泛素化，随后阻止TAK1的磷酸化并减少足细胞的下游炎症反应。该研究为未来开发针对OTUD5-TAK1轴的DKD治疗方法提供了理论基础和实验依据，为DKD的治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶点。
2024年6月，温州医科大学梁广团队在Nat Commun（IF=14.7）上，发表“Podocyte OTUD5 alleviates diabetic kidney disease through deubiquitinating TAK1 and reducing podocyte inflammation and injury”的研究成果。揭示了去泛素化酶OTUD5在足细胞损伤和糖尿病肾病中的作用机制。
Highlights如下：
1）OTUD5在糖尿病小鼠足细胞中的表达减少。
2）足细胞特异性OTUD5敲除加重足细胞损伤和DKD。
3）机制上，OTUD5通过其活性位点C224促进TAK1 K158位点发生K63连接的去泛素化，随后阻止TAK1的磷酸化并减少足细胞的下游炎症反应，突出了OTUD5作为DKD治疗靶点的潜力。临床相关性：OTUD5在糖尿病小鼠足细胞中的表达减少。功能研究：足细胞特异性OTUD5敲除或过表达能加重或抑制足细胞损伤和DKD，TAK1抑制剂缓解OTUD5敲除小鼠的肾损伤。
机制研究：
（1）鉴定TAK1为OTUD5潜在的底物蛋白
第一步，初步确定OTUD5潜在的底物蛋白作为去泛素化酶（DUB），OTUD5通过去泛素化底物蛋白起作用。利用IP-MS鉴定潜在的互作蛋白（图1a）。质谱鉴定的前15个潜在结合蛋白中，TAK1被证实在足细胞炎症和DKD进展中具有关键的调节作用（图1b）。因此，假设OTUD5通过去泛素化TAK1在足细胞中负调控炎症和损伤。
第二步，确定TAK1与OTUD5相互作用
内源性Co-IP实验证实，OTUD5与TAK1在细胞和小鼠肾组织均存在相互作用（图1c-d）。同时，外源性Co-IP实验也显示，OTUD5与TAK1相互作用（图1e）。
图1 TAK1与OTUD5相互作用（Ref. Fig 4/S4）
第三步，OTUD5诱导TAK1 K63连接的去泛素化
Co-IP实验分析显示，OTUD5过表达，降低TAK1的多泛素化水平（图2a）。为了确定TAK1泛素化连接的方式，构建Ub-WT、Ub-K48、Ub-K63和TAK1载体进行Co-IP分析，发现OTUD5降低TAK1的K63连接的泛素化，而不是K48连接的泛素化（图2b）。
第四步，OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化
研究表明，OTU5中的半胱氨酸224残基(C224)为脱泛素活性的必要位点。Co-IP分析显示，与野生型OTUD5相比，催化失活的OTUD5 C224S突变体可以正常与TAK1相互作用（图2c）；但未能从TAK1中去除K63连接的泛素分子（图2d）。表明OTUD5通过其活性位点C224切割TAK1的K63连接的泛素化。
第五步，TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点
迄今为止，TAK1蛋白中的四个赖氨酸(Lys)残基K34、K158、K209和K562已被确定为K63连接的多泛素化的潜在位点（图2e）。因此，为了探索哪些赖氨酸残基泛素化可以被OTUD5去除，构建了TAK1位点突变体，包括K34R、K158R、K209R和K562R。Co-IP分析显示，K158R突变体消除了OTUD5介导的去泛素化（图2f）。表明TAK1的赖氨酸残基K158是OTUD5去泛素化的特异性位点。
综上所述，OTUD5通过其活性位点C224降低k63连接的TAK1 K158位点的多泛素化。
图2 OTUD5通过其活性位点C224降低k63连接的TAK1 K158位点的多泛素化（Ref. Fig 4/S4）
（3）OTUD5负调控TAK1激活
第一步，OTUD5共同负调控TAK1-MAPK激活
WB检测证实，OTUD5过表达显著抑制HG/ pa诱导的足细胞TAK1磷酸化，但不改变TAK1总蛋白水平（图3a）。敲低OTUD5则相反（图3b）。MAPK通路是TAK1激活的主要下游信号，包括三个亚家族：JNK、ERK和p38。研究结果表明，在HG/ pa处理的足细胞中，OTUD5过表达也会抑制ERK、P38和JNK的激活，但OTUD5敲低会加剧ERK、P38和JNK的激活（图3c-d）。在HG/PA处理下，OTUD5共同负调控TAK1-MAPK激活。
第二步， OTUD5抑制TAK1与TAB2相互作用
TAK1磷酸化需要一个上游的激酶TAB2。据研究显示K63连接的TAK1多泛素化促进TAK1/TAB2复合物的形成，导致TAK1磷酸化。本研究中，OTUD5去除了TAK1的K63连接的泛素化，因此假设OTUD5可能会阻碍TAK1-TAB2的相互作用。Co-IP实验发现，OTUD5的过表达减少了TAK1与TAB2相互作用，而催化失活的突变体OTUD5-C224S则不能（图3e）。此外，在HG/ pa处理的足细胞中，OTUD5抑制TAK1-MAPK通路的激活，但OTUD5-C224S突变体则不能（图3f）。
第三步，OTUD5通过在K158位点阻断TAK1-TAB2相互作用来抑制TAK1的激活
OTUD5介导的TAK1失活是否依赖于TAK1在K158位点的去泛素化？
Co-IP分析显示，当TAK1中的K158突变为R残基时，TAK1与TAB2的相互作用减少，而OTUD5不能进一步影响TAK1与TAB2的相互作用（图3g）。同样，TAK1 K158R突变抑制TAK1- mapk在HG/PA刺激下的激活（图3h）。表明OTUD5通过在K158位点阻断TAK1-TAB2相互作用来抑制TAK1的激活。
图3 OTUD5负调控TAK1激活（Ref. Fig 5）
结论：该研究通过对高浓度葡萄糖和棕榈酸（HG/PA）处理的足细胞进行RNA测序，发现OTUD5显著下调。功能上，通过OTUD5过表达或TAK1抑制剂治疗，减轻足细胞损伤和DKD。机制上，OTUD5通过其活性位点C224促进TAK1 K158位点发生K63连接的去泛素化，随后阻止TAK1的磷酸化并减少足细胞的下游炎症反应。该研究为未来开发针对OTUD5-TAK1轴的DKD治疗方法提供了理论基础和实验依据，为DKD的治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶点。
